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單胺氧化酶（MAO）試劑盒說明書微量法 |
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單胺氧化酶（Monoamine Oxidase，MAO）試劑盒說明書 微量法 注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。 測定意義： MAO(EC1.4.3.4) 主要存在于脊椎動物的各種器官，特別是分泌腺、腦、肝臟，在無脊椎動物、豆類的芽等植物中也存在催化單胺類物質代謝，含量較低，具有重要的生理功能，其活 性能反映肝纖維化的程度。此外，MAO活性異常導致細胞內單胺類神經(jīng)遞質運轉出現(xiàn)紊亂，從而引發(fā)多種病癥。 測定原理： MAO催化單胺類底物脫氨生成相應的醛，進一步氧化成酸；底物在360nm處有特征吸收峰，測定360nm光吸收下降的速率，計算MAO活性。 自備實驗用品及儀器： 天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。 試劑組成和配制： 提取液一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。 提取液二：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。 試劑一：液體 60mL×2 瓶，4℃保存。 試劑二：液體 2mL×1 管，4℃避光保存。 粗酶液提取： 1. 稱取約0.1g樣品，加1mL預冷的提取液一充分冰浴勻漿，1000g，4℃，離心10min，棄沉淀；把上清轉移到另一預冷的離心管，10000g，4℃，離心30min，棄上清；加入1mL預冷的提取液二，震蕩混勻，16000g，4℃，離心40min，棄上清；沉淀加入預冷的1mL試劑一，震蕩混勻，即粗酶液（可用于可溶性蛋白濃度測定）。 2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，棄沉淀；把上清轉移到另一預冷的離心管，10000g，4℃，離心30min，棄上清；加入1.0mL預冷的提取液二，震蕩混勻，16000g，4℃，離心40min，棄上清；沉淀加入預冷的1.0 mL試劑一，震蕩混勻，即粗酶液（可用于可溶性蛋白濃度測定），取上清置于冰上待測。 3. 血清：直接測定。 測定操作表： 1、分光光度計/酶標儀預熱30min，調節(jié)波長至360nm。 2、操作表
注意：空白管只需測定一次。 MAO 活性計算公式： a．用微量石英比色皿測定的計算公式如下 1、按蛋白含量計算 酶活定義：37℃，pH7.6時，每毫克蛋白質1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。 DAO 活性（nmol/min/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V反總÷（V樣× Cpr）÷T= 114×ΔA÷Cpr 2、按樣本質量計算： 酶活定義：37℃，pH7.6時，每克樣品1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。 DAO 活性（nmol/min/g）=ΔA÷ε÷d×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T = 114×ΔA÷ W 3、按照細胞數(shù)量計算 酶活定義：37℃，pH7.6時，每104個細胞1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。 DAO 活性（nmol/min/104cell）=ΔA÷ε÷d×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量）÷T = 114×ΔA÷細胞數(shù)量 4、按照液體體積計算 酶活定義：37℃，pH7.6時，每升血清1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。 DAO 活性（nmol/min/L）=ΔA÷ε÷d×V 反總÷V 樣=114×ΔA ε ：底物摩爾消光系數(shù)，1460L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應總體積，0.2mL； V 樣：反應中樣本體積，0.02mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應時間，60min，W：樣本質量，g b．用 96 孔板測定的計算公式如下 1、按蛋白含量計算 酶活定義：37℃，pH7.6時，每毫克蛋白質1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。 DAO 活性（nmol/min/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T= 228×ΔA÷Cpr 2、按樣本質量計算： 酶活定義：37℃，pH7.6時，每克樣品1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。 DAO 活性（nmol/min/g）=ΔA÷ε÷d×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T = 228×ΔA÷ W 3、按照細胞數(shù)量計算 酶活定義：37℃，pH7.6時，每104個細胞1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。 DAO 活性（nmol/min/104cell）=ΔA÷ε÷d×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量）÷T = 228×ΔA÷細胞數(shù)量 4、 按照液體體積計算 酶活定義：37℃，pH7.6時，每升血清1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。 DAO 活性（nmol/min/L）=ΔA÷ε÷d×V 反總÷V 樣=228000×ΔA ε ：底物摩爾消光系數(shù)，1460L/mol/cm； d：96孔板光徑，0.5cm；V 反總：反應總體積，0.2mL；V 樣：反應中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應時間，60min，W：樣本質量，g 注意事項： 1、吸光度變化應該控制在 0.01～0.8 之間。否則加大樣品量或稀釋樣品，注意計算公式中參 與計算的稀釋倍數(shù)要相應改變。 2、樣品蛋白質含量需要另外測定。 實驗代做服務：
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